改性丝素蛋白支架与生长因子基因修饰脂肪间充质干细胞构建组织工程脂肪

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.016

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (52): 8450-8455.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.016

• 材料力学及表面改性 material mechanics and surface modification • 上一篇下一篇

改性丝素蛋白支架与生长因子基因修饰脂肪间充质干细胞构建组织工程脂肪

亢婷¹，王刚²，刘毅²，刘刚强²

¹兰州大学第二临床医学院，甘肃省兰州市 730061；²解放军兰州军区兰州总医院全军烧伤整形外科中心，甘肃省兰州市 730050

修回日期:2014-11-18 出版日期:2014-12-17 发布日期:2014-12-17
通讯作者: 刘毅，解放军兰州军区兰州总医院全军烧伤整形外科中心，甘肃省兰州市 730050
作者简介:亢婷，女，1988年生，河南省新乡市人，汉族，在读硕士，主要从事脂肪组织工程研究。
基金资助:
全军医学科研“十二五”重点项目(BWS11C061)

In vitro construction of tissue engineered adipose using vascular endothelial growth factor 165 gene-modified human adipose derived stem cells with chitosan-surface modified silk fibroin scaffolds

Kang Ting¹, Wang Gang², Liu Yi², Liu Gang-qiang²

¹Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730061, Gansu Province, China; ²Military Institute of Burns and Plastic Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Revised:2014-11-18 Online:2014-12-17 Published:2014-12-17
Contact: Liu Yi, Military Institute of Burns and Plastic Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Kang Ting, Studying for master’s degree, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730061, Gansu Province, China
Supported by:
the Military Medical Research Program during the Twelfth Five-Year Plan Period, No. BWS11C061

摘要/Abstract

摘要：

背景：构建工程化的脂肪组织，适宜的种子细胞和性能优良的支架材料缺一不可。

目的：探讨携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞后，与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料体外构建组织工程脂肪的可行性。

方法：选取生长良好的第3代人脂肪间充质干细胞，用携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒进行感染。将慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞成脂诱导14 d，油红O染色观察细胞的成脂能力；将慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞分别接种于壳聚糖修饰丝素蛋白支架材料上，MTT法检测细胞增殖能力；成脂诱导14 d后进行油红O染色，RT-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶增殖物活化受体γ2的表达。

结果与结论：成脂诱导14 d后，慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞均可见成熟脂肪细胞，组间差异不明显。慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞在改性丝素蛋白支架的生长曲线相近；成脂诱导后，油红O染色及RT-PCR均显示生成大量成熟脂肪细胞。表明携带重组人血管内皮细胞生长因子基因的慢病毒感染人脂肪间充质干细胞后，不影响其生长及成脂能力，与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料可成功构建组织工程化脂肪。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 人脂肪间充质干细胞, 慢病毒载体, 血管内皮细胞生长因子165, 改性丝素蛋白

Abstract:

BACKGROUND: To construct tissue-engineered adipose tissues, suitable seed cells and excellent performance of scaffold materials are indispensable.

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of constructing tissue-engineered adipose in vitro utilizing vascular endothelial growth factor 165 (VEGF165) gene-modified human adipose derived stem cells with chitosan-modified silk fibroin scaffolds.

METHODS: Passage 3 human adipose derived stem cells growing well were selected, and transfected with or without lentivirus-VEGF165-EGFP. To test the impact of lentivirus infection on adipogenic capability of human adipose derived stem cells, oil red O staining was performed after adipogenic induction for 14 days. To evaluate the proliferation and adipogenic capability of lentivirus infected human adipose derived stem cells on the chitosan-modified silk fibroin scaffolds, lentivirus infected and uninfected passage 3 human adipose derived stem cells were seeded on modified silk fibroin scaffolds respectively, and MTT tests were used to evaluate cell proliferation on the scaffolds. After adipogenic induction for 14 days, RT-PCR was performed to detect the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ-2. Besides, oil red O staining was adopted to illustrate the mature adipocytes.

RESULTS AND CONCLUSION: After adipogenic induction for 14 days, oil red O staining results showed mature adipocytes existed in lentivirus infected and uninfected passage 3 human adipose derived stem cells, and there was no statistical difference between lentivirus infected and uninfected cells. The proliferation curves of lentivirus infected and uninfected cells on the scaffolds showed no significant difference. After adipogenic induction for 14 days, oil red O staining and RT-PCR results could demonstrate that human adipose derived stem cells could be induced to mature adipocytes. These findings indicate that after infected by lentivirus-VEGF165-EGFP, the adipogenic differentiation and growth of human adipose derived stem cells cannot be affected. Lentivirus-infected human adipose derived stem cells can be combined with the chitosan-modified silk fibroin scaffolds to construct tissue-engineered adipose tissues successfully.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: tissue engineering, mesenchymal stem cells, entivirus infections, vascular endothelial growth factors

中图分类号:

R318

亢婷，王刚，刘毅，刘刚强. 改性丝素蛋白支架与生长因子基因修饰脂肪间充质干细胞构建组织工程脂肪[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(52): 8450-8455.

Kang Ting, Wang Gang, Liu Yi, Liu Gang-qiang. In vitro construction of tissue engineered adipose using vascular endothelial growth factor 165 gene-modified human adipose derived stem cells with chitosan-surface modified silk fibroin scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(52): 8450-8455.

图/表（结果） 3

2.1 人脂肪间充质干细胞的体外分离培养及形态学特点 原代细胞提取后培养24 h换液，利用不同细胞贴壁性的差异去除杂细胞，可见原代细胞呈短梭形(图1A)，培养至7-9 d时，细胞呈长梭形，形态规则；细胞达到80%融合时，可呈“漩涡”状排列(图1B)。

2.2 人脂肪间充质干细胞的体外成脂、成骨诱导 成脂诱导第3天，光镜下可见胞质内有少量折光性强的小脂滴形成，细胞形态由长梭形逐渐变圆；当成脂诱导14 d后，小脂滴融合形成大的脂滴，油红O染色呈阳性(图2A)。成骨诱导3 d后，细胞变为多角形，并开始聚集叠层样生长；诱导14 d后，细胞密集处经茜素红染色呈现红色的结节状沉淀物，表明有钙化结节形成(图2B)。细胞在体外具有多向分化能力证明了所提取细胞为人脂肪间充质干细胞。

2.3 壳聚糖/丝素蛋白支架的扫描电镜观察 壳聚糖/丝素蛋白支架材料呈海绵状，内部布满三维网状结构，孔隙彼此相连，孔隙率为90%，孔径大小为70-140 μm(图3)。

2.4 慢病毒感染人脂肪间充质干细胞 用携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒感染人脂肪间充质干细胞(MOI=50)，感染后的最初48 h内荧光显微镜下未见绿色荧光蛋白表达，感染72 h后可见微弱的荧光(图4A)，96 h后荧光明显增强，阳性率可达80%(图4B)。

2.5 慢病毒感染人脂肪间充质干细胞后的成脂诱导 成脂诱导14 d后，光镜下两组细胞胞质内均可见大小不等的脂滴，细胞形态由长梭形变为椭圆型。荧光显微镜下可见实验组被感染人脂肪间充质干细胞内大小不等的脂滴(图5A)。行油红O染色后，实验组(图5B)与对照组(图5C)均可见红色脂滴。使用Imge-Pro Plus图像分析软件计算每200倍视野油红O染色阳性面积和吸光度值(表1)并进行t 检验，结果显示两组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 慢病毒感染人脂肪间充质干细胞在壳聚糖/丝素蛋白支架材料上的生长增殖 MTT结果显示实验组与对照组细胞在壳聚糖/丝素蛋白支架材料上的生长无统计学差异(P > 0.05)，表明慢病毒感染后对人脂肪间充质干细胞在壳聚糖/丝素蛋白支架材料上的增殖能力无明显影响(图6)。

2.7 慢病毒感染人脂肪间充质干细胞在改性丝素蛋白上的成脂诱导 慢病毒感染的P3代人脂肪间充质干细胞和未感染的P3代人脂肪间充质干细胞分别接种于支架材料后，荧光显微镜下可以观察实验组呈现绿色荧光(图7A)。成脂诱导14 d后，油红O染色，光镜下实验组(图7B)和对照组(图7C)中均可见椭圆形的成熟脂肪细胞生成黏附于壳聚糖/丝素蛋白支架材料上。

RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳可见两组中成脂特异性基因过氧化物酶增殖物活化受体γ2条带(图8)，进一步表明慢病毒感染的人脂肪间充质干细胞在壳聚糖/丝素蛋白支架材料上经成脂诱导后可分化为成熟脂肪细胞。

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引言

材料方法

设计：体外对比观察性实验。

时间及地点：于2013年7至11月在解放军兰州军区兰州总医院骨科研究所完成。

材料：脂肪组织取自在解放军兰州军区兰州总医院全军烧伤整形外科中心接受整形手术的健康成年人，腹部全厚皮取皮后加工弃用的组织，事先经过患者及其家属知情同意。壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料由浙江大学闵思佳教授惠赠。

实验方法：

人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定：按本实验室建立的方法分离、培养人脂肪间充质干细胞^[6]，取第3代细胞分别进行成脂及成骨诱导。

慢病毒感染人脂肪间充质干细胞：选取生长良好的P3代人脂肪间充质干细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸L^-¹，接种于6孔板中，每孔1 mL。待细胞达到50%融合时，弃去培养基，加入1 mL含体积分数10%FBS、50 μL Enhanced Infection Solution(ENi.S.)的HG-DMEM，同时小心加入携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒(前期筛选试验表明感染复数MOI=50)。混合均匀后置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中，8 h后弃去6孔板中病毒液，更换为含体积分数10%FBS的HG-DMEM培养基，并于感染后24，48，72，96 h观察荧光的表达情况。

慢病毒感染人脂肪间充质干细胞的成脂诱导：选用慢病毒感染的P3代人脂肪间充质干细胞作为实验组，未感染的P3代人脂肪间充质干细胞作为对照组。实验组病毒感染72 h后和对照组分别进行成脂诱导(含1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX、100 μmol/L 吲哚美辛^[7])，每3 d更换培养基。成脂诱导14 d后行油红O染色，使用Imge-Pro Plus图像分析软件对图像进行分析处理，计算每200倍视野油红O染色阳性面积和积分吸光度，评估慢病毒感染对人脂肪间充质干细胞成脂能力的影响。

壳聚糖/丝素蛋白支架材料的处理及电镜观察：将壳聚糖/丝素蛋白支架剪裁成1 cm×1 cm×0.2 cm大小，置于玻璃瓶中，封口膜封口，γ射线辐照灭菌，辐射剂量10 kGy；用不含血清的HG-DMEM培养基浸泡24 h备用。另取一小块壳聚糖/丝素蛋白材料，4%戊二醛固定24 h，梯度乙醇脱水后行扫描电镜观察材料结构^[8]。

MTT法检测慢病毒感染人脂肪间充质干细胞在壳聚糖/丝素蛋白支架材料上的增殖：将辐照灭菌过的壳聚糖/丝素蛋白支架材料用DMEM培养基浸泡24 h后，裁剪成96孔板孔径大小后置于96孔板中。将慢病毒感染和未感染的P3代人脂肪间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，均调整细胞浓度至1×10⁷L^-1，分别接种于改性丝素蛋白支架材料上，每块材料40 μL，每个时间点两组均分别设5个复孔。两组均加入160 μL含体积分数10%FBS的HG-DMEM培养基后置于细胞培养箱中孵育。

MTT法检测接种后1，2，3，4，5，6，7 d两组细胞在支架材料上的生长曲线，评估慢病毒感染后，对人脂肪间充质干细胞在改性丝素蛋白材料上的增殖有无影响。

慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞在壳聚糖/丝素蛋白支架材料上成脂诱导：将辐照灭菌后的壳聚糖/丝素蛋白支架材料裁剪成1 cm×1 cm×0.2 cm大小，置于24孔板中，DMEM培养基浸泡24 h后备用。用胰酶消化收集慢病毒载体感染与未感染的P3代人脂肪间充质干细胞，将细胞浓度调成1×10⁹L^-¹，每块材料上滴加100 μL细胞悬液，放入37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中静置3 h后，加入1 mL含体积分数10%FBS的HG-DMEM培养基置于细胞培养箱中孵育，3 d后换成成脂诱导液，成脂诱导14 d后行油红O染色。

RT-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶增殖物活化受体γ2的表达：成脂诱导14 d后，取出两组细胞-支架复合物，Trizol法提取Total RNA，按照TaKaRa 公司的Prime Script ^TM RT reagent Kit试剂盒说明书，反转录得到cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq^TM Real-Time PCR 试剂盒说明书进行扩增。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火31 s，共进行40个循环。

RT-PCR引物序列：过氧化物酶增殖物活化受体γ2(307bp)，上游5’-TTC TCC TAT TGA CCC AGA AAG C-3’，下游5’-CTC CAC TTT GAT TGC ACT TTG G-3’；GAPDH(186 bp)，上游5’-CAC CCA CTC CTC CAC CTT TGA C-3’，下游5’-TCT CTT CCT CTT GTG CTC TTG C-3’^[9]，扩增产物以15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察并照相。

主要观察指标：携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞后，与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料体外构建组织工程脂肪的可行性。

统计学分析：所有数据均以x(_)±s表示，并应用SPSS 19.0统计软件对数据进行t 检验分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

任何组织、器官在体内存活、发挥功能都依赖血管供应营养物质、氧气和排除代谢产物。脂肪组织工程中，将构建的脂肪组织移植入体内后组织处于缺氧状态，只有快速形成血管网络为移植组织提供养分，细胞才能得以存活，因此血管化问题是脂肪组织工程的关键^[10]。目前构建血管化工程组织的方法主要有：支架材料的设计，体外预血管化、体内预血管化及血管化因子的应用^[11]。

现已知与血管生成相关的生长因子主要有：血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、人血管生成素1和肝细胞生长因子等。其中，血管内皮细胞生长因子是公认的作用最强、特异性最高的一种促血管生成因子，可以使血浆蛋白溢出血管外致纤维蛋白凝结，形成血管生成的临时基质，同时促进内皮细胞进一步形成成熟的血管基质，从而促进血管生成^[12]。血管内皮细胞生长因子家族包括血管内皮细胞生长因子A、B、C、D、E 5类，其中血管内皮细胞生长因子165属于血管内皮细胞生长因子A的分泌性生长因子，广泛存在于多种组织细胞中，不仅具有促进血管生成活性，而且其表达产物是可溶性的，表达后可从细胞中分泌出来，扩散性强，易到达靶细胞，从而很好地发挥生物学活性^[13]。纯化的血管内皮细胞生长因子165半衰期短，价格昂贵，体内给药困难，不能维持血管内皮细胞生长因子165的有效浓度，因此不能达到理想效果。随着基因工程技术的发展，此问题得到了很好解决。通过基因转染可以将外源血管内皮细胞生长因子165通过特定的载体导入靶细胞，使其在细胞内稳定高效表达^[14]。目前用于基因转染的载体主要有非病毒和病毒载体，病毒载体中主要包括腺病毒和慢病毒。腺病毒由于高感染率被广泛应用，但其携带的外源性基因不能整合于宿主染色体；慢病毒是一类免疫缺陷性病毒，其携带的外源性基因可以与宿主染色体整合，稳定地传给后代细胞，因此携带的外源性基因表达比腺病毒稳定和持久^[15]。携带血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒可以成功感染脂肪间充质干细胞，并大量、持续且稳定地分泌血管内皮细胞生长因子165，从而为血管化提供稳定的血管内皮细胞生成因子^[16]，因此，慢病毒是基因治疗的优良载体。

种子细胞的选择是脂肪组织工程的关键。大量实验结果表明，人脂肪间充质干细胞在体外具有多向分化潜能，能够分化为脂肪细胞、骨细胞、血管内皮细胞等，且能在体外大量扩增，因此人脂肪间充质干细胞是优良的组织工程种子细胞^[17]，在脂肪组织工程中更不失为一种理想的种子细胞^[18]。此外有研究表明，人脂肪间充质干细胞具有分泌多种血管生长因子的能力，可促进体内移植物的成活和血管化^[19]。本实验采用携带人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒感染人脂肪间充质干细胞，实验结果表明人脂肪间充质干细胞能够稳定表达外源基因，在成脂诱导剂的诱导下，人脂肪间充质干细胞能够分化为成熟的脂肪细胞，表明慢病毒感染不影响人脂肪间充质干细胞的成脂能力。

支架材料为组织工程的构建提供细胞黏附增殖的空间，性能优良的支架材料对于构建组织工程脂肪必不可少。本实验选用壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料，保留了丝素蛋白优良的机械性能和良好的生物相容性^[20]。同时，壳聚糖在中性溶液中带正电荷^[21]，而在此种环境中细胞带负电荷，因此能更容易黏附于支架材料表面，弥补了丝素蛋白在中性溶液中带负电荷^[3]、表面光滑^[4]、细胞不易黏附的不足。电镜结果表明，壳聚糖修饰的丝素蛋白呈海绵状，内部布满三维网状结构，孔隙彼此相连，孔隙率为90%，孔径大小为70-140 μm。将慢病毒感染的人脂肪间充质干细胞种植于壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料后，其增殖能力与未用慢病毒感染的人脂肪间充质干细胞没有统计学上的差异(P > 0.05)，成脂诱导后，慢病毒感染和未感染人脂肪间充质干细胞的成脂分化能力无统计学上的差异(P > 0.05)。

本实验采用携带人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒感染人脂肪间充质干细胞，然后接种于壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料，在体外成功构建出组织工程脂肪，为下一步体内构建血管化组织工程脂肪奠定了基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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